产品货号：
LA10304
中文名称：
EdU-Alexa Fluor 488细胞增殖检测试剂盒(适用于FACS、FM)
英文名称：
EdU Cell Proliferation Kit with Alexa Fluor 488(suitable for FACS、FM)
产品规格：
50-500T|200-2000T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是一种利用核苷渗入法对细胞增殖情况进行快速、简单、高灵敏检测的试剂盒。使用本试剂盒所做结果可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪或荧光酶标仪进行检测，也可以用于高内涵筛选(HCS)。
本试剂盒适用于培养的细胞或组织样品，也适用于组织切片，可以检测到细胞或组织样本中的单个增殖细胞，也可以对细胞或组织样本总体的细胞增殖情况进行定量分析。本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组份，同时提供了蓝色细胞核染料Hoechst 33342，可以用来复染所有细胞核，也可用于细胞周期分析。
试剂盒中的EdU(5-ethynyl-2' -deoxyuridine)是一种胸苷(T)类似物，EdU可以在在细胞周期的S期中替代胸苷掺入到新合成的DNA中；另一方面，EdU上的乙炔基能与叠氮化物(如荧光探针Alexa Fluor 488 Azide)通过Cu+的催化发生共价反应，形成稳定的三唑环，该反应非常迅速，被称作点击反应(Click reaction) (图1)。通过点击反应，新合成的DNA会被绿色荧光标记，然后通过检测荧光信号实现细胞增殖的检测。
图1．EdU法中的点击反应原理图。掺入到细胞DNA中的EdU与荧光探针或生物素等标记的叠氮化物，在铜离子的催化下发生共价反应，形成稳定的三唑环，使细胞DNA标记上荧光探针或生物素。
细胞增殖检测是评估细胞活性、遗传毒性及抗肿瘤药物效果等的基础实验手段。细胞增殖检测的方法按照原理通常可以分为五类：膜损伤检测、代谢活性检测、ATP水平测定、DNA合成检测和细胞荧光标记检测法。目前公认的最精确的检测细胞增殖的方法是直接检测细胞中DNA的合成，即核苷渗入法。以前常用的核苷渗入法是BrdU(胸腺嘧啶核苷酸类似物)法，但BrdU法的缺点是需要变性DNA后才能与抗体结合，导致了DNA双链结构的破坏，影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。
EdU法作为新型的核苷渗入法具有以下优点：
- 安全：不使用[3H]thymidine，无放射性污染。
- 简单：基于小分子化学反应的检测方法，简单高效，仅需三步：EdU孵育；细胞固定；荧光检测。无需DNA变性和孵育抗体。
- 快速：无需过夜，省却抗原抗体反应。整个检测过程只需2.5小时，大大缩短实验周期。
- 准确：标记率高且无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免变性带来的样品损伤，确保细胞核边缘清晰完。
- 灵敏：无需抗体，检测染料仅为BrdU抗体的1/500，更容易扩散，即使单个增殖细胞也能准确检测。
- 兼容：对样品几乎无损伤，允许与多种抗体或荧光蛋白同时标记，能够同时检测细胞其他性状特征。
| 组分 | LA10304S (50-500T) | LA10304M (200-2000T) |
| EdU(10mM) | 200μL | 800μL |
| 488-Azide | 55μL | 220μL |
| Click-iT Reaction Buffer | 30mL | 120mL |
| CuSO4 | 1.1mL | 4.4mL |
| Click-iT Additive | 2管 | 1瓶 |
| Hoechst 33342(1000X) | 50μL | 200μL |
| 说明书 | 1份 | 1份 |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- 针对6孔板培养的细胞(每孔500μL的Click反应液)，LA10304S可以提供50个孔反应的量；LA10304M可以提供200个孔反应的量。
- 针对96孔板培养的细胞(每孔50μL的Click反应液)，LA10304S可以提供500个孔反应的量；LA10304M可以提供2000个孔反应的量(不同容器细胞Click反应液的具体用量可参考表1)。
- 针对每管细胞数量为10～100万的流式细胞仪检测(每管500μL的Click反应液)，LA10304S可以提供50管反应的量，LA10304M可以提供200管反应的量。
- 针对冰冻或石蜡切片的检测(每个样品100～200μL的Click反应液)，LA10304S可以提供125～250个样品反应的量，LA10304M可以提供500～1000个样品反应的量。
488-Azide：绿色荧光，Ex/Em=491/518nm；
Hoechst 33342：蓝色荧光，Ex/Em=346/460nm,bound to DNA。
- 羟基脲(Hydroxyurea，货号：LA14601)为DNA合成抑制剂，经过10mM羟基脲提前30min处理的细胞，绿色荧光阳性的细胞几乎完全消失，因此常被用作EdU实验的阴性对照。
- 配制好的Click-iT Additive Solution请根据每次用量适当分装后-20℃保存，避免反复冻融。Click-iT Additive Solution融化后有白色物质析出为正常现象，请上下颠倒几次，待全部溶解后使用。溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解，不能再使用。
- 皂苷促渗液可以用于全血及含红细胞的细胞悬液，以及其他含多种细胞类型的混合细胞悬液的通透。这种促渗液可以在裂解红细胞的同时，维持白细胞的光散射特性。
- 本试剂盒做动物实验时可能需要更多的EdU(货号：LA13603)，请根据实验需求用合适稀释液稀释后使用。
- 由于本制品涉及到铜离子催化进行点击反应，请注意以下的兼容性问题及解决方案。本制品完全兼容有机类染料如Alexa Fluor系列普通染料及FITC、APC及APCE串联染料；对于Qdot纳米晶体探针、HRP、R-PE和R-PE-串联染料如Alexa Fluor 680- R-PE等，需要在点击反应完成后进行反应和检测；本制品会影响GFP、RFP、mCherry等荧光蛋白的荧光，对于荧光类蛋白如GFP、TC-FlAsH和TC-ReAsH类试剂，需要在点击反应前进行反应和检测。Phalloidin (鬼笔环肽)不兼容点击反应，在检测细胞微管时请选用其它探针。
- 如需在传统流式仪上进行总DNA含量的检测，可采取低流速检测。DNA含量检测所用荧光检测信号应与DNA含量成线性关系。EdU标记信号呈现对数放大可以很好的被检测到。
- 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
- 需自备试剂
- 10mM PBS,pH7.2～7.6 (货号：LA10131)。
- 固定液：4%多聚甲醛in PBS (货号：LA10973)。
- 洗涤液：3% BSA in PBS,pH7.2～7.6。
- 通透液：0.3～0.5% Triton X-100 in PBS。
- 去离子水或超纯水。
- 10mM PBS,pH7.2～7.6 (货号：LA10131)。
- 检测体系的确定
- 以下操作步骤是以6孔板或常规切片检测体系为例的，如果使用其他容器，检测体系可以相应按比例调整，具体检测时Click反应液的使用量请参考表1。
- 以下操作步骤是以贴壁细胞或组织切片为例的，如果检测的是悬浮细胞，请按常规的悬浮细胞的操作方式进行，比如在相关步骤中增加离心步骤等。细胞数在10～100万的悬浮细胞可以使用500μL的检测体系，可以根据细胞数的多少相应调整检测体系。
表1.Click反应液的使用量参考细胞接种容器 384孔板 96孔板 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5cm皿 Click反应液体积 20μL 50μL 70μL 100μL 200μL 500μL 1mL
- 以下操作步骤是以6孔板或常规切片检测体系为例的，如果使用其他容器，检测体系可以相应按比例调整，具体检测时Click反应液的使用量请参考表1。
- EdU标记与固定、通透
- 对于培养细胞
- 将适当数量的待测细胞接种于6孔板中，培养过夜至恢复正常状态后，进行所需要的药物处理或者其它刺激处理。
- 配制2X EdU工作液：用完全培养基稀释EdU(10mM)至合适的浓度，配成2X的EdU工作液。例如，推荐的EdU工作液(1X)的终浓度为10μM，那么需要用完全培养液1:500稀释EdU(10mM)至浓度为20μM，即配成2X EdU工作液(20μM)。
注：EdU的使用浓度应根据所使用的的细胞类型做相应的优化，推荐用户以10μM的EdU初始浓度进行摸索优化，一般的贴壁肿瘤细胞使用10μM就可以。细胞培养基种类、细胞类型、细胞生长密度和增殖速度等多方面因素都有可能影响EdU的掺入效果，因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳浓度。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。您也可以参考附表1.细胞实验EdU孵育浓度及时间参考。 - 37℃预热2X EdU工作液，等体积加入6孔板中，使6孔板中的EdU终浓度变为1X。例如如果终浓度为10μM，6孔板中每孔原来有培养基1mL，则将1mL 2X EdU工作液(20μM)加入到每孔中。如果培养基原有体积过大，可以先吸除适量的培养基，再加入与剩下培养基等体积的2X EdU工作液；或者可以增加EdU的浓度并减少工作液的体积，例如2mL培养液中加入220μL 10X EdU工作液(100μM)。
注：更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响，因此不建议更换所有的培养液。 - 继续孵育细胞适当时间。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率，通常宜继续孵育细
胞周期10%左右的时间。您也可以参考附表2.常见细胞系EdU孵育时间参考。
注：孵育时间小于45min时，建议提高EdU的浓度；孵育时间大于20h时，建议适当降低EdU的浓度。 - EdU标记完成后，去除培养基。
注：若最后做流式检测，样本为贴壁细胞，则用胰酶将细胞消化下来，收集细胞，之后每一步去除液体的步骤都需要500～1000×g离心3～5min。 - 加入1mL固定液，室温固定15～30min。
- 去除固定液，以每孔1mL的洗涤液洗涤细胞3次，每次3～5min。
- 去除洗涤液，加入1mL通透液，室温孵育10～15min。
- 去除通透液，以每孔1mL的洗涤液洗涤细胞1～2次，每次3～5min。
- 转步骤4。
- 将适当数量的待测细胞接种于6孔板中，培养过夜至恢复正常状态后，进行所需要的药物处理或者其它刺激处理。
- 对于组织切片样本
可以通过注射或进食等方式进行动物体内的EdU标记。以下是以小鼠为例的，其它动物体内EdU标记条件请参考相关文献，也可以参考附表3进行条件优化。- 用PBS配制成一定浓度的EdU，对于小鼠，可按照10～200mg/kg的用量进行腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水。
注：EdU具体用量与动物的种类、体重和使用方式有关，可以参考相关文献，因此建议用户在预实验中设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳浓度。推荐用户以50mg/kg的EdU初始浓度进行摸索优化。如果之前使用过BrdU进行实验，则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。也可以参考附表2。 - EdU标记4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也根据相关参考文献自行调整。
- 对于冰冻切片：
① 加入适量固定液，室温固定15min。
② 去除固定液，用适量洗涤液洗涤3次，每次3～5min。
③ 去除洗涤液，加入适量通透液，室温孵育10～15min。
④ 去除通透液，用适量洗涤液洗涤1～2次，每次3～5min。
⑤ 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
⑥ 转步骤4。 - 对于石蜡切片：
① 脱蜡：二甲苯中脱蜡5～10min。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10min。无水乙醇5min，换新的无水乙醇3min。95%乙醇3min。85%乙醇3min。75%乙醇3min。50%乙醇3min。PBS 5min。
② 抗原修复(选做)：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
注：如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复，修复后须反复洗涤干净，避免残留的酶干扰后续标记反应。
③ 转步骤4。
- 用PBS配制成一定浓度的EdU，对于小鼠，可按照10～200mg/kg的用量进行腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水。
- 对于培养细胞
- EdU检测
注：本参考步骤每个样品的反应体系为500μL的Click反应液。用户可根据自己的样本情况参考表1适当调整。对于切片，可以根据切片大小，每个切片使用100～200μL的Click反应液，其余步骤相同。- 配制Click-iT Additive Solution：对于LA10304S，用1.3mL去离子水/管溶解Click-iT Additive；对于LA10304M，用10.4mL去离子水/瓶溶解Click-iT Additive。混匀至全部溶解，即为Click-iT Additive Solution。配制后请按照每次用量适当分装，并-20℃保存，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。
- 请参考下表配制Click反应液。
注：请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液，否则Click反应可能无法有效进行。Click反应液须在配制后15分钟内使用。成分 以6孔板为例的样品数 1 2 5 10 50 Click-iT Reaction Buffer 430μL 860μL 2.15mL 4.3mL 21.5mL CuSO4 20μL 40μL 100μL 200μL 1mL 488-Azide 1μL 2μL 5μL 10μL 50μL Click-iT Additive Solution 50μL 100μL 250μL 500μL 2.5mL 总体积 500μL 1mL 2.5mL 5mL 25mL - 去除上一步骤中的洗涤液。每孔加入500μL Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保Click反应液可以均匀覆盖样品。
- 室温避光孵育30min。
- 吸除Click反应液，以每孔1mL的洗涤液洗涤细胞3次，每次3～5min。
- 此时增殖细胞被标记了明亮的绿色荧光。如无其它特殊要求，即可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪(用500μL洗涤液重悬细胞后上机)、多功能酶标仪、高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要细胞核复染)进行荧光检测分析。488-Azide的最大激发波长是491nm，最大发射波长是518nm。如果需要检测细胞增殖的比例，可以参照步骤5对细胞核进行复染。
- 配制Click-iT Additive Solution：对于LA10304S，用1.3mL去离子水/管溶解Click-iT Additive；对于LA10304M，用10.4mL去离子水/瓶溶解Click-iT Additive。混匀至全部溶解，即为Click-iT Additive Solution。配制后请按照每次用量适当分装，并-20℃保存，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用。
- 细胞核染色
- 1X Hoechst 33342溶液的配制：用PBS按1:1000比例稀释Hoechst 33342(1000X)。
- 吸除步骤4.e洗涤液，每孔加1mL的1X Hoechst 33342溶液，室温避光孵育10min。
- 吸除1X Hoechst 33342溶液，以每孔1mL的洗涤液洗涤细胞3次，每次3～5min。
- 随后即可进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光，最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm。
- 1X Hoechst 33342溶液的配制：用PBS按1:1000比例稀释Hoechst 33342(1000X)。
附表1．细胞实验EdU孵育浓度及时间参考
| PubMed ID | Reference | Cell line | Concentration | Time |
| 18272492 | Salic A,et al.PNAS.2008 | NIH3T3,Hela | 10 nM～10μM | 1h |
| 18521918 | Cappella P,et al.Cytometry A.2008 | HL-60,A2780,U2OS | 1～10μM | 30min |
| 18996411 | Chehrehasa F,et al.J Neurosci Methods.2009 | Neurospheres | 1～20μM | 24h |
| 19179371 | Limsirichaikul S,et al.Nucleic Acids Res.2009 | Human primary fibroblasts | 10μM | 0.5,1,2,4h |
| 19253396 | Warren M,et al.Dev Dyn.2009 | Chick embryos | 10μM～2mM | 4h |
| 19647746 | Yu Y,et al.J Immunol Methods.2009 | Spleen cells | 50μM | 24h |
| 19544417 | Momcilovic O,et al.Stem Cells.2009 | Human ES cells | 10μM | 30min |
| 20080700 | Cinquin O,et al.PNAS.2010 | emb-30 | 1μM | 12h |
| 20025889 | Han W,et al.Life Sci.2009 | VSMC | 50μM | 2h |
| 20659708 | Huang C,et al.J Genet Genomics.2010 | ESC | 50μM | 2h |
| 21310713 | Hua H,et al.Nucleic Acids Res.2011 | fission yeast strains | 10μM | 3h |
| 20824490 | Lv L,et al.Mol Cell Biochem.2011 | EJ cells | 50μM | 4h |
| 21248284 | Yang S,et al.Biol Reprod.2011 | GC cells | 50μM | 2h |
| 21227924 | Zhang YW,et al.Nucleic Acids Res.2011 | U2OS,HT29 | 30μM | 90min |
| 21829621 | Guo T,et al.PloS One.2011 | HIT-T15 | 50μM | 4h |
| 21980430 | Zeng T,et al.PloS One.2011 | MCF-10A | 25μM | 2h |
| 22012572 | Ding D,et al.Int Orthop.2011 | C3H10T1/2 | 10μM | 24h |
| 22000787 | Zeng W,et al.Biomaterials.2011 | EPC | 50μM | 4h |
| 21913215 | Xue Z,et al.J Cell Biochem.2011 | SGC7901 | 25μM | 24h |
| 22016038 | Peng F,et al.Lasers Med Sci.2011 | MSC | 50μM | 2h |
| 21878637 | Li D,et al.J Biol Chem.2011 | HCC | 50μM | 2h |
附表2．常见细胞系EdU孵育时间参考
| 细胞系 | 人胚胎细胞 | 酵母细胞 | 小鼠胚胎成纤维细胞 NIH/3T3 | 人宫颈癌细胞 Hela | 人胚肾细胞系 HEK293 | 人神经细胞 |
| 细胞周期 | ~30min | ~3h | ~18h | ~21h | ~25h | ~5d |
| 孵育时间 | 5min | 20min | 2h | 2h | 2h | 1d |
附表3．动物实验EdU标记时间及剂量参考
| PubMed ID | Reference | Species | Method | Amount | Time | Tissue |
| 18272492 | Salic A,et al.PNAS.2008 | Mice | 腹腔注射 | 100μg | 96h | 脑 |
| 19554638 | Kaiser CL,et al.Laryngoscope.2009 | Chicken | 皮下注射 | 50mg/kg | 72h | 耳蜗 |
| 19494148 | Guo F,et al.J Neurosci.2009 | Mice | 腹腔注射 | 100mg/kg | 3h | 脑 |
| 19179611 | Veres.TZ,et al.Am J Pathol.2009 | Mice | 腹腔注射 | 50mg/kg | 3h/20h | - |
| 20664699 | Wiley LA,et al.Mol Vis.2010 | Mice | 腹腔注射 | 100～200μg | 1h | 眼 |
| 20163731 | Schmidt EJ,et al.BMC Dev Biol.2010 | Mice | 腹腔注射 | 200μg | 30min | 胚胎 |
| 20064490 | Zeng C,et al.Brain Res.2010 | Mice | 腹腔注射 | 50mg/kg | 4h~30d | 脑 |
| 20038597 | Janas ML,et al.J Exp Med.2010 | Mice | 腹腔注射 | 100μg | 4h | 胸腺 |
| 21145612 | Sun H,et al.J Hepatol.2011 | Mice | 腹腔注射 | 100μg | 72h | - |
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